توسعه بیوسنسور الکتروشیمیایی dna برای تشخیص ژن ویروس هپاتیت c به روش ولتامتری پالس تفاضلی

در کار پژوهشی حاضر توسعه بیوسنسور الکتروشیمیایی dna جهت تشخیص ژن ویروس هپاتیت c بر پایه استفاده از الکترودهایی نظیر مغز مداد گرافیتی (pge) و الکترود طلا انجام گرفته است. در بخش نخست این مطالعه، یک بیوسنسور dna جهت شناسایی الیگونوکلئوتید کوتاه مربوط به ژن ویروس هپاتیت c ژنوتیپ 1a بر اساس استفاده از سیگنال اکسایش گوانین و pge، طراحی شده است. اساس ساخت این بیوسنسور، تثبیت الیگونوکلئوتید تک رشته ای 20-مری (phcv1a) مربوط به این ژن بر روی pge می باشد و فرایند تشکیل هیبرید بین پروب و الیگونوکلئوتیدمکمل آن (hcv1a) با استفاده از ولتامتری پالس تفاضلی مورد مطالعه قرار گرفت. به منظور بررسی انتخابگری بیوسنسور، از الیگونوکلئوتیدهای غیرمکمل مختلف استفاده شد. پارامترهای مختلف موثر در کارکرد بیوسنسور نظیر صیقل دادن الکترود، پیش تیمار الکتروشیمیایی الکترود و پارامترهای دخیل (پتانسیل و مدت زمان پیش تیمار)، همچنین شرایط تثبیت پروب (مانند پتانسیل و مدت زمان تثبیت پروب) مورد بررسی قرار گرفت و شرایط بهینه برای هرکدام مشخص گردید. در شرایط بهینه حد تشخیص روش برابر با nm 5/6 محاسبه شد. در بخش دوم این مطالعه، یک بیوسنسور الکتروشیمیایی dna با استفاده از پروب pnaی تیول دار و بکارگیری شناساگر mb جهت شناسایی الیگونوکلئوتید کوتاه مربوط به ژن ویروس هپاتیت c ژنوتیپ 3a در سطح الکترود طلا (aue) تهیه گردید. اساس ساخت بیوسنسور، تثبیت الیگونوکلئوتید تک رشته ای 14-مری (phcv3a) مربوط به ژن ویروس هپاتیت c ژنوتیپ 3a به روش خودانباشتگی در سطح aue می باشد. شرایط پیش تیمار الکترود و تثبیت پروب با استفاده از سیگنال ولتامتری چرخه ای در محلول fe(cn)63-/4-به عنوان پروب الکتروشیمیایی بهینه گردید. فرایند تشکیل هیبرید بین پروب و الیگونوکلئوتیدمکمل آن (hcv3a) با استفاده از سیگنال احیای mb مورد مطالعه قرار گرفت. به منظور بررسی انتخابگری بیوسنسور، از الیگونوکلئوتیدهای غیرمکمل مختلف استفاده شد. پارامترهای مختلف موثر در عملکرد بیوسنسور مورد مطالعه قرار گرفت و شرایط بهینه گزارش شد. کارایی تجزیه ای بیوسنسور بررسی شد و حد تشخیص m 11-10× 8/5 به دست آمد. در بخش سوم کار بیوسنسور طراحی شده برای اولین بار به طور موفقیت آمیزی برای تشخیص الیگونوکلئوتیدهای دورشته ای (ds-dna) مربوط به ژن ویروس هپاتیت c ژنوتیپ 3a مورد استفاده قرار گرفت. اساس روش افزایش سیگنال شناساگر mb متعاقب انجام فرایند هیبریداسیون بین pna و dnaی دورشته ای (ds-dna) و تشکیل تریپلکس pna-ds-dna می باشد. انتخابگری بیوسنسور در حضور الیگونوکلئوتیدهای دورشته ای غیرمکمل مختلف مورد بررسی قرار گرفت. پارامترهای متعدد موثر در عملکرد بیوسنسور بررسی شد و حد تشخیص m 12-10× 79/1 به دست آمد. در قسمت چهارم از این پژوهش الکترود طلای اصلاح شده با لایه های خود انباشته از پروب pnaی 20 مر مربوط به ناحیه حفاظت شده در ژن پروتئین core ویروس هپاتیت c جهت تشخیص الیگونوکلئوتید دورشته ای مکمل با طول کوتاه و تمایز توالی مکمل از اشتباه تک بازی (sbm) مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از سیگنال ولتامتری پالس تفاضلی mb انباشت شده در سطح الکترود شرایط بهینه برای تثبیت پروب به دست آمد. به منظور بررسی انتخابگری بیوسنسور، از الیگونوکلئوتیدهای غیرمکمل مختلف استفاده شد. پارامترهای مختلف موثر در عملکرد بیوسنسور مورد مطالعه قرار گرفت و حد تشخیص بیوسنسور در شرایط بهینه حاصله و در زمان هیبریداسیون 2 ساعت m 12-10× 63/9 به دست آمد. در قسمت پنجم از کار حاضر، بیوسنسوری جهت شناسایی cdnaی کد کننده پروتئین core ویروس هپاتیت c در قالب پلاسمید نوترکیب (pbkc84) به طول 4568 جفت باز، تولید شده در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دارویی دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران، طراحی و ساخته شد. در این مطالعه از phcvuni به عنوان پروب استفاده شد و سیگنال احیای mb با تکنیک ولتامتری پالس تفاضلی ثبت گردید. انتخابگری بیوسنسور با استفاده از پلاسمید غیرمکمل (pet21a(+)) ارزیابی شد. پارامترهای متعددی جهت دستیابی به انتخابگری بهتر و حساسیت بیشتر مورد مطالعه قرار گرفت. کارایی تشخیص این بیوسنسور بررسی شد و حد تشخیص pg/µl 52/9 به دست آمد. در قسمت پایانی این کار پژوهشی، بیوسنسور طراحی شده بطور موفقیت آمیزی برای تشخیص cdnaی کد کننده پروتئین core ویروس هپاتیت c در زنجیره های دورشته ای محصولات pcr مورد استفاده قرارگرفت. شناسایی مستقیم الکتروشیمیایی ژن هپاتیت c در محصولات pcr بدون نیاز به خالص سازی آن، با استفاده از بیوسنسور dna طراحی شده بر روی الکترود طلا و با بکارگیری سیگنال احیای متیلن بلو قابل دستیابی است. افزایش سیگنال شناساگر mb بعد از انجام هیبریداسیون پروب pna با محصول دورشته ای pcr نشان دهنده تشکیل هیبرید pna-ds-dna در سطح الکترود و داخل شدن شناساگر در هیبرید می باشد و این امکان را فراهم می کند که بیوسنسور مذکور جهت تشخیص dna به صورت دوپلکس مورد استفاده قرار گیرد. این بیوسنسور از حساسیت و انتخابگری بسیار خوبی در برابر محصولات pcr غیرمکمل و همچنین ناخالصی های موجود در محصول pcr برخوردار است و حد تشخیص روش pg/µl 47/4 به دست آمد.